بررسی اثر عصاره برگ زیتون و ترکیب اصلی آن(اولئوروپئین) بر سمیت سلولی ناشی از 6-هیدروکسی دوپامین در سلول های PC12

بررسی اثر عصاره برگ زیتون و ترکیب اصلی آن(اولئوروپئین) بر سمیت سلولی ناشی از 6-هیدروکسی دوپامین در سلول های PC12
بیماری پارکینسون یک اختلال تخریب کننده نورونی شدید و پیش رونده سیستم عصبی مرکزی است که یکی از شایع ترین اختلالات حرکتی می­باشد. برای اکثر بیماری‌های تخریب کننده عصبی اقدامات موجود حکم مسکن را دارند. به علت اینکه شواهد متعددی پیشنهاد می­کنندکه دربسیاری از بیماری‌های تخریب کننده نورونی مرگ سلولی غیر عادی رخ می­دهد، داروهایی که بتوانند مرگ سلولی را متوقف کنند ممکن است از تخریب نورونی بیشتر جلوگیری کرده و پیشرفت بیماری را آهسته کنند. ترکیبات عمده عصاره برگ زیتون فنول هایی مانند اولئوروپئین می­باشند، که آثار ضد آپوپتوزی از خود نشان می­دهند بنابراین، مطالعه حاضر جهت بررسی اثر عصاره برگ زیتون و اولئوروپئین بر سمیت سلولی ناشی از 6-هیدروکسی دوپامین بر روی سلول‌های PC12 به عنوان مدل in vitro بیماری پارکینسون طراحی شد. جهت القاء سمیت سلولی، سلول‌های PC12 با 150 میکرومول 6-هیدروکسی دوپامین تیمار شدند. در گروه­های درمانی دوزهای متفاوت برگ زیتون(g/mlμ600-100) واولئوروپئین(g/mlμ25-5) جهت بررسی اثر احتمالی محافظت کننده آنهااستفاده شد. سمیت سلولی توسط تست MTT تعیین شد. میزان ROS داخل سلولی توسط پروب فلورسنس دی­کلرو فلورسین دی استات از طریق روش فلوریمتری ارزیابی شد. قطعات DNA وپارامترهای بیوشیمیایی آپوپتوز (Bax, Bcl2 و caspase3) به ترتیب توسط الکتروفورز در ژل آگارز و ایمونوبلاتینگ ارزیابی شدند. نتایج ما نشان دادند که افزایش 6-هیدروکسی دوپامین منجر به افزایش میزان آسیب سلولی، تولید ROS داخل سلولی، فعال شدن کاسپاز3، قطعه­قطعه شدن DNA و همچنین افزایش نسبت Bax/Bcl2 می­گردد. تیمار با عصاره برگ زیتون(μg/ml 400و600) و اولئوروپئین ( μg/ml20و25) اختلالات ذکر شده را کاهش می­دهد. روی هم رفته نتایج پیشنهاد می­کنند که عصاره برگ زیتون و اولئوروپئین در برابر آپوپتوز القاء شده در اثر 6-هیدروکسی دوپامین اثر محافظت کننده نورونی دارند. حداقل بخشی از این اثر محافظت کننده به واسطه کاهش آپوپتوز نورونی اعمال می­گردد و پیشنهاد کننده پتانسیل دارویی عصاره برگ زیتون و اولئوروپئین برای کاهش تخریب عصبی سلول­های دوپامینرژیک می‌باشد.

کلمات کلیدی:عصاره برگ زیتون، 6-هیدروکسی دوپامین، آپوپتوز، سلول­هایPC12، اولئوروپئین.

فهرست مطالب:
فصل اول… 1

1-1 معرفی بیماری پارکینسون. 2

1-2 فاکتورهای دخیل در بیماری پارکینسون. 4

1-2-1 افزایش سن.. 4

1-2-2 فاکتور های محیطی.. 4

1-3 سیستم یوبی کوئیتین پروتئوزوم 16

1-3-1 فاکتورهای ژنتیکی دخیل دربیماری پارکینسون. 17

1-4 التهاب عصبی و بیماری پارکینسون. 21

1-4-1 نقش فعال شدن گلیال ها در بیماری پارکینسون. 22

1-4-2 تغییرات ریز محیط ها در بیماری پارکینسون. 23

1-5 معرفی گیاه زیتون. 23

1-5-1 خصوصیات شیمیایی عصاره برگ زیتون. 24

1-6 اولئوروپئین به عنوان ترکیب اصلی برگ زیتون. 28

فصل دوم.. 30

2-1 مواد و روشها 31

2-1-1 وسایل مورد استفاده. 31

2-1-2 مواد و داروهای مورد استفاده. 31

2-1-3 بافرها و محلولهای مورد استفاده. 32

2-2 جمع آوری برگ زیتون. 34

2-3 تهیه عصاره برگ زیتون. 34

2-4 کشت سلول. 35

2-5 سنجش بقای سلولی. 35

2-5-1 MTT assay 35

2-6 سنجش ROS داخل سلولی. 37

2-6-1 گروه‌های مورد استفاده در تست ROS. 38

2-7 استخراج DNA از سلول‌های PC12 39

2-7-1 گروه‌های مورد آزمایش جهت استخراج DNA 40

2-8 الکتروفورز قطعات DNA.. 41

2-8-1 گروه‌های مورد آزمایش در وسترن بلات… 41

2-8-2 استخراج پروتئین از سلول‌های PC12 42

2-8-3 اندازه گیری کل پروتئین.. 43

2-8-4 بررسی میزان پروتئینهای درگیر در آپوپتوز (Bax, Bcl-2, Caspase 3) با استفاده از روش وسترن بلات 44

2-8-5 الکتروفورز پروتئینها روی ژل SDS-PAGE.. 44

2-8-6 انتقال از ژل به کاغذ PVDF. 45

2-8-7 بلاکینگ 46

2-8-8 مرحله شستشو. 46

2-8-9 اضافه کردن آنتی بادی اولیه. 47

2-8-10 اضافه کردن آنتی بادی ثانویه. 47

2-8-11 افزودن سوبسترا و ثبت باندهای نورانی روی فیلم رادیولوژی.. 47

2-8-12 ظهور فیلم.. 48

2-8-13 زدودن آنتی بادیهای متصل به آنتی ژن از روی کاغذ و کنترل لودینگ نمونه ها 48

2-8-14 آنالیز تصاویر گرفته شده از باندهای پروتئینی.. 49

2-9 آنالیز آماری. 49

فصل سوم.. 50

3-1 نتایج. 51

3-1-1 بررسی تأثیرات غلظتهای متفاوت 6-هیدروکسی دوپامین بر بقای سلول‌های PC12. 51

3-1-2 بررسی اثرات دوزهای متفاوت عصاره بر سلول‌های PC12 52

3-1-3 بررسی اثرات دوزهای متفاوت اولئوروپئین بر سلول‌های PC12 53

3-1-4 بررسی اثرات دوزهای متفاوت عصاره برگ زیتون(OLE) بر بقای سلول‌های PC12کشت شده در حضور 6-هیدروکسی دوپامین.. 54

3-1-5 بررسی اثرات دوزهای متفاوت اولئوروپئین بر بقای سلول‌های PC12کشت شده در حضور 6-هیدروکسی دوپامین 55

3-1-6 بررسی اثرات دوزهای موثر عصاره برگ زیتون بر میزان تولید ROS داخل سلولی ناشی از 6-هیدروکسی دوپامین 56

3-1-7 بررسی اثرات دوزهای موثر اولئوروپئین بر میزان تولید ROS داخل سلولی ناشی از 6-هیدروکسی دوپامین 57

3-1-8 آنالیز نتایج به دست آمده از وسترن بلات برای پروتئینهای درگیر در آپوپتوز سلولی.. 58

3-1-9 بررسی اثرات عصاره برگ زیتون واولئوروپئین بر قطعه قطعه شدن DNA ناشی از 6-هیدروکسی دوپامین 63

فصل چهارم.. 64

4-1 بحث و نتیجه گیری. 65

4-2 بروز استرس اکسیدایتو وآپوپتوز در بیماری پارکینسون. 65

4-3 عملکرد کانال های کلسیم و بیماری پارکینسون. 72

4-4 بروز التهاب نورونی در بیماری پارکینسون. 73

4-5 نتیجه گیری کلی. 76

4-6 پیشنهادها 77

فهرست اشکال:

شکل 1- 1:تولید گونه های واکنش پذیر اکسیژن د راثر پارکوات 8

شکل 1- 2: مکانسیم القاء سمیت عصبی توسط 6-هیدروکسی دوپامین.. 13

شکل 3- 1:بررسی اثر غلظت‌های متفاوت 6-هیدروکسی دوپامین بر بقای سلول‌های PC12 با استفاده از تست MTT 51

شکل 3- 2: بررسی اثر غلظت‌های متفاوت عصاره برگ زیتون بر بقای سلول‌های PC12 با استفاده از تست MTT 52

شکل 3- 3: بررسی اثر غلظت‌های متفاوت اولئوروپئین بر بقای سلول‌های PC12 با استفاده از تست MTT 53

شکل 3- 4: بررسی اثر غلظت‌های متفاوت عصاره برگ زیتون بر بقای سلول‌های PC12 در حضور 6-هیدروکسی دوپامین با استفاده از تست MTT. 54

شکل 3- 5: بررسی اثر غلظت‌های متفاوت اولئوروپئین بر بقای سلول‌های PC12 در حضور 6-هیدروکسی دوپامین با استفاده از تست MTT. 55

شکل 3- 6: بررسی اثر غلظت‌های متفاوت عصاره برگ زیتون بر میزان ROS تولید شده در حضور 6-هیدروکسی دوپامین 56

شکل 3- 7: بررسی اثر غلظت‌های متفاوت اولئوروپئین بر میزان ROS تولید شده در حضور 6-هیدروکسی دوپامین 57

شکل 3- 8: بررسی بیان کاسپاز 3 فعال شده در گروه‌های تیمار شده با 6-هیدروکسی دوپامین و عصاره برگ زیتون 59

شکل 3- 9: بررسی بیان کاسپاز 3 فعال شده در گروه‌های تیمار شده با 6-هیدروکسی دوپامین و اولئوروپئین 60

شکل3- 10: بررسی بیان نسبت Bax/Bcl-2 در گروه‌های تیمار شده با 6-هیدروکسی دوپامین و عصاره برگ زیتون 61

شکل3- 11: بررسی نسبت Bax/Bcl-2 در گروه‌های تیمار شده با 6-هیدروکسی دوپامین و اولئوروپئین 62

شکل3- 12:بررسی قطعه قطعه شدن DNA در حالت تیمار با 6-هیدروکسی دوپامین همراه با دوزهای موثر اولئوروپئین و عصاره برگ زیتون. 63